寨卡来袭:又一场没有硝烟的战争

  

引言 

   寨卡病毒(Zika virus)于1947年首次在乌干达寨卡丛林中的恒河猴上被发现(1)。随后在1954年,从一名10岁的尼日利亚女孩的血清中分离出首例人类寨卡病毒(2)。但在之后的半个多世纪中,只有不到20病例报道,仅多局限在非洲和东南亚。 

  2007年,寨卡病毒突然在西太平洋的雅浦岛(Island of Yap)大流行。在4个月内,当地6900人的总人口中大约有5000人被感染,感染率将近72.6%(3)。然而由于其当时出现的临床症状较轻,除轻微发热症状之外,住院率很低没有重症危险(4, 5),所以该病没得到太多的关注。在2013年法属泊利尼西亚岛大爆发中,3万余人被感染,而且在寨卡病毒流行期间,格林巴利综合症(Guillain–Barre syndrome)发病率比以往高出20倍以上(6),而且有病人在确诊感染一周后就表现出格林巴利综合症症状(7) 

  在刚刚过去的2015年,拉丁美洲爆发寨卡病毒大流行,其中巴西受害最严重,约有百万余人被寨卡病毒感染(8)。巴西卫生部报告在巴西东北部新生儿小脑症人群异常增加,并认为可能与怀孕母亲感染寨卡病毒相关(9)。据统计,2010-2014年之间,巴西平均每年会有163例小头症新生儿(10),而在2015年中旬到20161月底,有4783个小头症及其疑似病例被报道(包括新生儿和流产儿)(11) 

  随着科学研究的深入,越来越多的证据表明新生儿小头症与寨卡病毒感染怀孕母亲有关(12-17)20162月,世界卫生组织(WHO)宣布了将寨卡病毒的流行作为全球公共卫生紧急突发事件(18)20163月,世界卫生组织(WHO)制定紧急处理计划,世界卫生组织及其主要成员伙伴将分别投入2500万美元和3100万美元来支持计划的实施(19)。下面就该病的病原学流行病学临床表现、诊断和科学研究热点问题做一简述。   

 

寨卡病毒的病毒学特征 

   寨卡病毒隶属于黄热病毒科,黄热病毒属。黄热病毒包括很多人们熟悉的病毒,其中有黄热病毒(Yellow fever virus,登革热病毒(Dengue virus,日本脑炎病毒/乙脑病毒(Japanese encephalitis virus)和西尼罗河病毒(West Nile virus)等等。绝大多数黄热病毒的结构和生命周期都很相似(20)。所以通过已有对黄热病毒的知识,我们可以推测出寨卡病毒一些特性,为对其诊断和治疗提供依据。 

  黄热病毒是一种正译单链RNA病毒。成熟的黄热病毒颗粒是由包膜蛋白(Envelope protein,膜蛋白(Membrane protein)和衣壳蛋白(Capsid protein)三种结构蛋白构成的20面体结构的颗粒。近期,寨卡病毒的结构已经通过冷冻电镜技术被解析出来,成熟的寨卡病毒颗粒结构与登革热病毒和西尼罗河病毒相似,同时其154位的天冬氨酸糖基化位点可能与其感染有关(21)。在其结构蛋白内部,包裹着黄热病毒的基因组RNA,全长大约11000个碱基。其基因组RNA两端有5’端和3’端两个非翻译区(UTRs);中间为一个单独开放阅读框,将会编码翻译出3个结构蛋白和7个非结构蛋白。目前,很多不同株型的寨卡病毒的基因组已经被全基因组测序出来(22-24),其基因组RNA组成顺序符合黄热病毒基因组RNA组成顺序,也为5UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3UTR(25) 

  在黄热病毒与侵染的宿主细胞上的受体结合后,会诱导主要由网格蛋白介导的细胞内吞过程。伴随着在内吞过程中内吞体内的pH值不断降低,黄热病毒的包膜蛋白会经历一次结构重组,由原先的二聚体形式变为三聚体形式。这种结构变化会使病毒暴露其膜融合结构(fusion loop),使病毒与内吞体的膜结构相互融合,进而将病毒的基因组RNA释放到细胞胞质中(26, 27)。病毒基因组进入细胞胞质后会编码翻译成一个多聚蛋白,这个多聚蛋白会被宿主细胞和病毒的不同酶剪切成3个结构蛋白(衣壳蛋白(C,前提膜蛋白(prM)和包膜蛋白(E))与7个非结构蛋白(NS1NS2A,NS2B,NS3NS4A,NS4B,NS5(28)。在病毒复制复合体上,病毒的基因组RNA会根据双链RNA模板来复制,并且几乎所有非结构蛋白都参与了病毒基因组RNA复制的过程。之后病毒会在被感染细胞内的膜结构上组装形成病毒颗粒,并按照从内质网到高尔基体再到细胞膜的顺序从细胞中释放新生成的病毒。 

    

寨卡病毒的传播途径 

蚊虫传播 

  寨卡病毒是一种由蚊子传播的虫媒类病毒。在通过蚊子传播寨卡病毒时,分为森林传播循环与城镇传播循环。在森林传播循环中,主要在非人灵长类动物和蚊子之间传播,维持寨卡病毒的种群;而城镇传播循环中,蚊子和人类则变为寨卡病毒主要的宿主(29)。目前,被认为能在人类中传播寨卡病毒的蚊子有Ae.aegypti, Ae.albopictus, Ae.hensilliAe.polynesiensis,其中Ae.aegypti(埃及伊蚊)与Ae.albopictus(白纹伊蚊)被认为与近期寨卡病毒大爆发有密切联系(29)。不同地域的埃及伊蚊与白纹伊蚊对病毒的易感性也有所不同,而其中亚洲的新加坡种系的埃及伊蚊对寨卡病毒较为易感。据报道,让新加坡种埃及伊蚊口服感染寨卡病毒,5天内62%的蚊子唾液腺中可以检测到寨卡病毒,到10天的时候所有的伊蚊都可在其唾液腺中检测到寨卡病毒(30)。埃及伊蚊与白纹伊蚊主要生活在人类居住地周围且好食人血,在其一次吸血过程中会叮咬数名个体,这也大大增加了其在不同个体间传染病毒的几率(31) 

性传播 

   最早发现寨卡病毒又可能性传播是2008(32)。一名在塞内加尔进行科研工作的美国科学家在回国后表现出了类似被寨卡病毒感染的症状。随后,他的妻子也表现出相似病症,经检查发现二人都感染了寨卡病毒。然而他的妻子从没有离开过美国,唯一被感染的可能就是与已经被感染的丈夫发生了性关系。2015年,一名在塔西提岛被寨卡病毒感染的病人的精液和尿液中发现了寨卡病毒(33),进而为寨卡病毒可能通过性传播提供了科学依据。近两年,美国CDC监测到了多例与寨卡病毒感染的病人发生性关系而被传染寨卡病毒的病例(34, 35)。美国CDC针对避免寨卡病毒性传播给出了若干建议,包括孕妇应尽量避免与从寨卡疫区返回的伴侣发生性关系,其他人群应正确使用避孕套,及从疫区归来者在短期内不允许捐精等(36, 37) 

母婴传播 

   黄热病毒,如登革热病毒,有报道可以通过母婴传播(38, 39)。所以寨卡病毒也可能通过母婴传播。在泊利尼西亚寨卡病毒大爆发时,有报道称寨卡病毒感染的孕妇分娩产生的婴儿也有寨卡病毒感染的症状(40)。近期巴西怀孕异常新生儿的孕妇羊水中检测到了寨卡病毒的RNA(13),已分娩的异常新生儿的部分组织中也检测出了寨卡病毒RNA(16, 41)。这些报道提示寨卡病毒在感染孕妇之后可以穿越胎盘进一步感染婴儿。此外,在被寨卡病毒感染的母亲的乳汁中也检测到了寨卡病毒RNA,但还没有证据证明新生儿通过吸食母乳而被感染。 

    

寨卡病毒的临床表现 

寨卡热 

   寨卡病毒的潜伏期不清楚,按照黄热病毒的潜伏期推算,是蚊虫叮咬后3-14(42)。感染者中只有20%会表现出临床症状,剩下80%呈潜伏感染(3)。感染寨卡病毒之后的症状相对较轻。常见的有起疹(90%),发烧(65%),关节炎或关节痛(65%),非化脓性结膜炎(55%),肌肉痛(48%),头痛(45%),后眼眶痛(39%),浮肿(19%)和呕吐(10%(29)。少数其它症状也可能与寨卡病毒感染有关,如耳鸣,手和膝盖肿胀,以及皮下渗血。症状会持续几天到几周。寨卡症状最早期的症状为一般为头痛低烧,持续时间较短。发烧48小时内出疹,一般在脸,躯干以及手足。发烧症状一般会在起疹后24-48小时内消失(43) 

格林巴利综合症 

   格林巴利综合征是一种免疫反应攻击周围神经系统而造成的自身免疫性疾病。主要症状是肌肉进行性衰弱,随着病情加重,病人会出现四肢瘫痪,呼吸困难和吞咽障碍,神经系统损伤导致心跳血压不稳定等。在法属波利尼西亚群岛,在20092012年期间,每年格林巴利综合征发病人数仅为3-10(44)。然而,在2013年寨卡病毒流行期间,出现了42例格林巴利综合征病例。在这42例病人中,41人(98%)有抗寨卡病毒的IgGIgM42人(100%)有针对寨卡病毒的中和性抗体,而无格林巴利综合征的住院病人中,只有56%有针对寨卡病毒的抗体(45)。此外,42名病人中3174%)人是男性(45)。从20151月到7月,在巴西东北几个州报道了121例病例,其中62%病人在发病前有过寨卡热病症。同样,54%的萨尔瓦多患者表示有过同样的经历(44) 

新生儿小头症 

   小头症表现为婴儿脑部在被怀孕期间没有发育到正常体积(I型小头症)或出生后脑部衰退(II型小头症)(46)I型小头症不仅表现为脑部周长异常,而且会表现出运动障碍,视觉障碍,听觉障碍和认识障碍等一些列脑部损伤症状,严重的小头症会导致新生儿死亡(47)。在一例感染寨卡病毒的孕妇32周终止妊娠的小头症胎儿尸检中发现胎儿无脑回,有脑积水,皮质位移和大脑皮层与皮下白质多灶点性钙化等症状(15)。造成小头症的因素既可以是婴儿自身基因突变或基因缺陷,也可以是外界因素造成的。外界因素中很重要的一个原因就是怀孕的母亲被病原体感染,已知的病原体主要包括弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒,疱疹病毒,梅毒螺旋体(TORCHS factors)等(48)。目前证据表明寨卡病毒感染孕妇很可能是造成婴儿小头症。 

   2015年,伴随着寨卡病毒在巴西的大流行,疫区内新生儿小头症的病例数目比以往上升20余倍(49)。目前,寨卡病毒的RNA已经在小头症婴儿母亲的羊水中被检测出来(13);小头症婴儿的大脑皮层,延脑和脑脊髓等脑组织中也检测到了寨卡病毒RNA(50);感染性寨卡病毒颗粒从小头症胎儿的脑组织中被分离出来(51);CT成像技术显示寨卡病毒感染可能干扰了新生儿脑发育(52)。综上,寨卡病毒感染有可能导致婴儿小头症几乎已成定论。 

    

寨卡病毒感染的实验室诊断 

RT-PCR检测 

  检测到病人血清中的寨卡病毒核酸(RT-PCR测试)可以提供确切的诊断。然而,这种方法的检测时间窗口很短,为临床发病后37天,发病后10天以上就很难测试出阳性结果(53, 54)。而在孕妇中,可以在感染后大约10周检测到血清中的病毒核酸,暗示胎儿感染病毒(51)。在有症状的病人中,血清中的病毒核酸载量大约从7*1069*108;而无症状的感染者中,大约只有2.5*103(37, 54-56)。感染者的尿液中也可以检测出病毒RNA,并且比血液中的更长,从而加长检测时间窗口(57, 58)。此外,病人的唾液中也可以检测出病毒RNA,并且比血清样本有更高的敏感度(59)。但是唾液与血清的检测结果并不完全一致,有的病人可以从血清中检测到病毒RNA,却不能在唾液中检测到(59) 

  在使用RT-PCR检测寨卡病毒RNA的时候有两种策略,一种为使用黄热病毒保守序列引物,另一种为使用寨卡病毒自身特异性的引物(55)。目前,通过黄热病毒保守序列引物可以检测寨卡病毒的靶基因有ENS1NS3NS5基因(60-63)。而使用寨卡病毒自身特异性引物来检测虽然敏感性很高,但是由于覆盖不了所有株系的基因多样性,所以会导致假阴性(64)。目前使用的针对寨卡病毒自身特异性的引物都是2007年法国波利尼西亚大爆发之后开发的,其检测的靶基因有EpE(partial E)M-E链接区和NS5基因(54, 64-66) 

血清型检测 

   血清型检测的检测方式有ELISA检测(enzyme-linked immunosorbent assay)和PRNT检测(Plaque reduction neutralization test)。 

  寨卡病毒ELISA检测的时间窗口虽然还没有被精确的确定,但是根据其他黄热病毒的经验,可以由几天到数月(67)ELISA检测方便、快捷,方法成熟(68, 69),大多数实验室中都可以完成。但是因为针对不同黄热病毒的抗体之间有较强的交叉反应,所以使得用ELISA检测寨卡病毒的结果会被患者之前感染的其他黄热病毒的抗体所干扰,例如登革热病毒(3)。所以开发高效特异性的寨卡病毒ELISA检测商用试剂盒仍然有迫切需求。 

   PRNT检测是区分相关类似病毒特异性最高的一种特异性检测方法(70)。在寨卡病毒血清型鉴定过程中,PRNT检测通常用来验证ELISA检测的正确性及排除其他黄热病毒抗体的干扰(70, 71)。然而由于PRNT检测需要使用活病毒,所以必须在有特定条件的实验室中进行。此外,PRNT检测反应所需要时间较长(通常需要数日),而且工作量较大,所以PRNT检测不适合快速筛查使用。   

寨卡病毒的治疗及预防 

  寨卡病毒属于黄病毒,目前临床上已有若干疫苗可用于不同的黄病毒的预防,例如从1937年开始应用的黄热病毒减毒疫苗YF-17D。借鉴这些已有的疫苗的研制方法对寨卡病毒疫苗的研发有指导作用。但是由于寨卡病毒可以通过母婴传播,孕妇接种灭活及减毒疫苗时应更为小心。除此之外,寨卡病毒引起格林巴利综合症的原因尚不明确,研制疫苗时应尽量避免自身免疫性免疫原。 

  目前对于任何黄病毒还没有特效的药物(72)。在抗登革病毒药物取得了一定进展,由于寨卡病毒和登革病毒的相似性,我们可以借鉴登革病毒研究的方法研发抗寨卡药物。此外,在药物设计上,力争使药物渗透入大脑,从而防止病毒在婴儿的大脑中繁殖;同时,设法让药物在其他组织、器官产生出高效的抗病毒能力。 

  已知最有效、可行的方法就是控制传播途径,即控制蚊子数量。在20世纪后半期,使用DDT和其他高毒性杀虫剂在控制蚊子数量上取得了显著成果,但是带来的极大的环境危害,这些方法被政府取缔(73)。目前,一些环保新方法正在试用。其中一种是释放遗传上有所改造的伊蚊,该蚊子存在一个在幼虫期可以致死的基因,可使其后代死亡,从而减少蚊子数量,该方法已经在小范围内取得良好的效果(74)。另一种方法是通过释放感染Wolbachia细菌的埃及伊蚊,Wolbachia细菌可以通过自然途径传播,干扰埃及伊蚊的复制,从而减少蚊子的数量。该方法已经应用到登革流行区,对蚊子的数量及疫情的发生达到控制(75) 

  到目前为止,还没有防御寨卡病毒的疫苗,也没有对该病毒进行治疗的有效药物。因此,控制寨卡病毒的传播媒介十分必要。     

 

总结 

   伴随着全球变暖,适合蚊子栖息环境的面积扩大。到疫区旅游的人数增加,开发丛林带出丛林病毒等一系列因素,导致中国和全世界其它国家面临越来越严重的虫媒类病毒的侵扰。寨卡病毒的爆发式的来袭给人们敲起了警钟。2016年巴西里约热内卢将举办2016夏季奥运会,届时全世界游客及运动员将聚集巴西,而蚊虫也将处繁殖旺季。如若不能很好地预防控制寨卡病毒,届时疫情传播可能比现在更加惨烈。 

  现在我们对寨卡病毒生活周期和致病机理等了解还比较匮乏。同时抗病毒药物、预防性疫苗和快速精准检测试剂盒也有所空缺。针对目前的需要,世界卫生组织已经开始展开寨卡病毒疫情防控计划,美国总统奥巴马也请求国会批准19亿美元紧急资金来用于寨卡病毒的防治与研究。 

  我国和世界各国科学家们为了解寨卡病毒,设计预防治疗寨卡病毒正在进行积极的努力。寨卡病毒感染人皮肤细胞及神经祖始细胞的机制性研究已经被报道(14, 76),寨卡病毒感染的小鼠及猴子模型已经被建立(77-79),这无疑将为寨卡病毒疫苗及药物的保护性的检测带来极大的便利。相信不久的将来,我们将会有足够的手段来防控和治疗寨卡病毒,并最终赢取这场没有硝烟的战争的胜利。 


    

参考文献 

  1.    Dick GW, Ktichen SF, and Haddow AJ. 1952. Zika viurs. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg 46:509-520. 

  2.    Macnamara FN. 1954. Zika virus: a report on three cases of human infection during an epidemic of jaundice in Nigeria. Trans R Soc Trop Med Hyg 48:139-145. 

  3.    Duffy MR, Chen TH, Hancock WT, et al. 2009. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. N Engl J Med 360:2536-2543. 

  4.    Musso D, Cao-Lormeau VM, and Gubler DJ. 2015. Zika virus: following the path of dengue and chikungunya? Lancet 386:243-244. 

  5.   Paixao ES, Barreto F, Da Gloria Teixeira M, et al. 2016. History, Epidemiology, and Clinical Manifestations of Zika: A Systematic Review. Am J Public Health 106:606-612. 

  6.    Musso D, Nilles EJ, and Cao-Lormeau VM. 2014. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect 20:O595-596. 

  7.    Oehler E, Watrin L, Larre P, et al. 2014. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill 19. 

  8.    Bogoch II, Brady OJ, Kraemer MUG, et al. 2016. Anticipating the international spread of Zika virus from Brazil. The Lancet 387:335-336. 

  9.    Schuler-Faccini L, Ribeiro EM, Feitosa IM, et al. 2016. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly - Brazil, 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 65:59-62. 

  10.   Organization. PaHOWH 17 January 2016, posting date. Epidemiological- update neurological syndrome, congenital anomalies, and Zika virus infection. Washington, D.C. : PAHO/WHO. [Online.] 

  11.   Victora CG, Schuler-Faccini L, Matijasevich A, et al. 2016. Microcephaly in Brazil: how to interpret reported numbers? The Lancet 387:621-624. 

  12.   Ventura CV, Maia M, Bravo-Filho V, et al. 2016. Zika virus in Brazil and macular atrophy in a child with microcephaly. The Lancet 387:228. 

  13.   Calvet G, Aguiar RS, Melo AS, et al. 2016. Detection and sequencing of Zika virus from amniotic fluid of fetuses with microcephaly in Brazil: a case study. Lancet Infect Dis. 

  14.   Tang H, Hammack C, Ogden SC, et al. 2016. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 

  15.   Nowakowski TJ, Pollen AA, Di Lullo E, et al. 2016. Expression Analysis Highlights AXL as a Candidate Zika Virus Entry Receptor in Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 

  16.   Mlakar J, Korva M, Tul N, et al. 2016. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med 374:951-958. 

  17.   Cauchemez S, Besnard M, Bompard P, et al. 2016. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. Lancet. 

  18.   Gulland A. 2016. Zika virus is a global public health emergency, declares WHO. BMJ 352:i657. 

  19.   Organization WH 3 March 2016 2016, posting date. Zika Outbreak: WHO's Global Emergency Response Plan. World Health Organization. [Online.] 

  20.   Liang H, Lee M, and Jin X. 2016. Guiding dengue vaccine development using knowledge gained from the success of the yellow fever vaccine. Cell Mol Immunol 13:36-46. 

  21.   Sirohi D, Chen Z, Sun L, et al. 2016. The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 

  22.   Deng YQ, Zhao H, Li XF, et al. 2016. Isolation, identification and genomic characterization of the Asian lineage Zika virus imported to China. Sci China Life Sci. 

  23.   Kuno G, and Chang GJ. 2007. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol 152:687-696. 

  24.   Baronti C, Piorkowski G, Charrel RN, et al. 2014. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc 2. 

  25.   Rice CM, Lenches EM, Eddy SR, et al. 1985. Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution. Science 229:726-733. 

  26.   Modis Y, Ogata S, Clements D, et al. 2004. Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion. Nature 427:313-319. 

  27.   Kuhn RJ, Zhang W, Rossmann MG, et al. 2002. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell 108:717-725. 

  28.   Murphy BR, and Whitehead SS. 2011. Immune response to dengue virus and prospects for a vaccine. Annu Rev Immunol 29:587-619. 

  29.   Petersen LR, Jamieson DJ, Powers AM, et al. 2016. Zika Virus. N Engl J Med. 

  30.   Li MI, Wong PS, Ng LC, et al. 2012. Oral susceptibility of Singapore Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus) to Zika virus. PLoS Negl Trop Dis 6:e1792. 

  31.   Gubler DJ. 2002. The global emergence/resurgence of arboviral diseases as public health problems. Arch Med Res 33:330-342. 

  32.   Foy BD, Kobylinski KC, Chilson Foy JL, et al. 2011. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis 17:880-882. 

  33.   Musso D, Roche C, Robin E, et al. 2015. Potential sexual transmission of Zika virus. Emerg Infect Dis 21:359-361. 

  34.   Hills SL, Russell K, Hennessey M, et al. 2016. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 65:215-216. 

  35.   Mccarthy M. 2016. Zika virus was transmitted by sexual contact in Texas, health officials report. BMJ 352:i720. 

  36.   Oster AM, Brooks JT, Stryker JE, et al. 2016. Interim Guidelines for Prevention of Sexual Transmission of Zika Virus - United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 65:120-121. 

  37.   Oster AM, Russell K, Stryker JE, et al. 2016. Update: Interim Guidance for Prevention of Sexual Transmission of Zika Virus - United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 65:323-325. 

  38.   Basurko C, Carles G, Youssef M, et al. 2009. Maternal and fetal consequences of dengue fever during pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 147:29-32. 

  39.   Tan PC, Rajasingam G, Devi S, et al. 2008. Dengue infection in pregnancy: prevalence, vertical transmission, and pregnancy outcome. Obstet Gynecol 111:1111-1117. 

  40.   Besnard M, Lastere S, Teissier A, et al. 2014. Evidence of perinatal transmission of Zika virus, French Polynesia, December 2013 and February 2014. Euro Surveill 19. 

  41.   Ventura CV, Maia M, Bravo-Filho V, et al. 2016. Zika virus in Brazil and macular atrophy in a child with microcephaly. Lancet 387:228. 

  42.   Rudolph KE, Lessler J, Moloney RM, et al. 2014. Incubation periods of mosquito-borne viral infections: a systematic review. Am J Trop Med Hyg 90:882-891. 

  43.   Martinez De Salazar P, Suy A, Sanchez-Montalva A, et al. 2016. Zika fever. Enferm Infecc Microbiol Clin. 

  44.   Musso D, and Gubler DJ. 2016. Zika Virus. Clin Microbiol Rev 29:487-524. 

  45.   Cao-Lormeau VM, Blake A, Mons S, et al. 2016. Guillain-Barre Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 

  46.   Woods CG, and Parker A. 2013. Investigating microcephaly. Arch Dis Child 98:707-713. 

  47.   Gilmore EC, and Walsh CA. 2013. Genetic causes of microcephaly and lessons for neuronal development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 2:461-478. 

  48.   Neu N, Duchon J, and Zachariah P. 2015. TORCH infections. Clin Perinatol 42:77-103, viii. 

  49.   Hennessey M, Fischer M, and Staples JE. 2016. Zika Virus Spreads to New Areas - Region of the Americas, May 2015-January 2016. Am J Transplant 16:1031-1034. 

  50.   Sarno M, Sacramento GA, Khouri R, et al. 2016. Zika Virus Infection and Stillbirths: A Case of Hydrops Fetalis, Hydranencephaly and Fetal Demise. PLoS Negl Trop Dis 10:e0004517. 

  51.   Driggers RW, Ho CY, Korhonen EM, et al. 2016. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 

  52.   Hazin AN, Poretti A, Cruz DD, et al. 2016. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. N Engl J Med. 

  53.   Bearcroft WG. 1956. Zika virus infection experimentally induced in a human volunteer. Trans R Soc Trop Med Hyg 50:442-448. 

  54.   Lanciotti RS, Kosoy OL, Laven JJ, et al. 2008. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis 14:1232-1239. 

  55.   Waehre T, Maagard A, Tappe D, et al. 2014. Zika virus infection after travel to Tahiti, December 2013. Emerg Infect Dis 20:1412-1414. 

  56.   Aubry M, Richard V, Green J, et al. 2016. Inactivation of Zika virus in plasma with amotosalen and ultraviolet A illumination. Transfusion 56:33-40. 

  57.   Roze B, Najioullah F, Ferge JL, et al. 2016. Zika virus detection in urine from patients with Guillain-Barre syndrome on Martinique, January 2016. Euro Surveill 21. 

  58.   Kutsuna S, Kato Y, Takasaki T, et al. 2014. Two cases of Zika fever imported from French Polynesia to Japan, December 2013 to January 2014 [corrected]. Euro Surveill 19. 

  59.   Musso D, Roche C, Nhan TX, et al. 2015. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol 68:53-55. 

  60.   Gaunt MW, and Gould EA. 2005. Rapid subgroup identification of the flaviviruses using degenerate primer E-gene RT-PCR and site specific restriction enzyme analysis. J Virol Methods 128:113-127. 

  61.   Meiyu F, Huosheng C, Cuihua C, et al. 1997. Detection of flaviviruses by reverse transcriptase-polymerase chain reaction with the universal primer set. Microbiol Immunol 41:209-213. 

  62.   Chow VT, Seah CL, and Chan YC. 1993. Use of NS3 consensus primers for the polymerase chain reaction amplification and sequencing of dengue viruses and other flaviviruses. Arch Virol 133:157-170. 

  63.   Scaramozzino N, Crance JM, Jouan A, et al. 2001. Comparison of flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. J Clin Microbiol 39:1922-1927. 

  64.   Faye O, Diallo D, Diallo M, et al. 2013. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J 10:311. 

  65.   Balm MN, Lee CK, Lee HK, et al. 2012. A diagnostic polymerase chain reaction assay for Zika virus. J Med Virol 84:1501-1505. 

  66.   Faye O, Dupressoir A, Weidmann M, et al. 2008. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. J Clin Virol 43:96-101. 

  67.   Busch MP, Kleinman SH, Tobler LH, et al. 2008. Virus and antibody dynamics in acute west nile virus infection. J Infect Dis 198:984-993. 

  68.   Johnson AJ, Martin DA, Karabatsos N, et al. 2000. Detection of anti-arboviral immunoglobulin G by using a monoclonal antibody-based capture enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 38:1827-1831. 

  69.   Martin DA, Muth DA, Brown T, et al. 2000. Standardization of immunoglobulin M capture enzyme-linked immunosorbent assays for routine diagnosis of arboviral infections. J Clin Microbiol 38:1823-1826. 

  70.   Roehrig JT, Hombach J, and Barrett AD. 2008. Guidelines for Plaque-Reduction Neutralization Testing of Human Antibodies to Dengue Viruses. Viral Immunol 21:123-132. 

  71.   Kuno G. 2003. Serodiagnosis of flaviviral infections and vaccinations in humans. Adv Virus Res 61:3-65. 

  72.   Lim SP, Wang QY, Noble CG, et al. 2013. Ten years of dengue drug discovery: progress and prospects. Antiviral research 100:500-519. 

  73.   Gubler DJ. 1987. Dengue and dengue hemorrhagic fever in the Americas. Puerto Rico health sciences journal 6:107-111. 

  74.   Wise De Valdez MR, Nimmo D, Betz J, et al. 2011. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108:4772-4775. 

  75.   Ritchie SA, Townsend M, Paton CJ, et al. 2015. Application of wMelPop Wolbachia Strain to Crash Local Populations of Aedes aegypti. PLoS neglected tropical diseases 9:e0003930. 

  76.   Hamel R, Dejarnac O, Wichit S, et al. 2015. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol 89:8880-8896. 

  77.   Rossi SL, Tesh RB, Azar SR, et al. 2016. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. Am J Trop Med Hyg. 

  78.   Lazear HM, Govero J, Smith AM, et al. 2016. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 

  79.   Butler D 2016, posting date. Zika researchers release real-time data on viral infection study in monkeys. Nature. [Online.]